工作原理

1983年，WALZ公司首席科学家，德国乌兹堡大学教授Ulrich Schreiber博士利用调制技术和饱和脉冲技术，设计制造了全世界第一台脉冲振幅调制（Pulse-Amplitude-Modulation，PAM）荧光仪——PAM-101/102/103。

所谓调制技术，就是说用于激发荧光的测量光具有一定的调制（开/关）频率，检测器只记录与测量光同频的荧光，因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光，包括背景光很强时。正是由于调制技术的出现，才使得叶绿素荧光由传统的“黑匣子”（避免环境光）测量走向了野外环境光下测量，由生理学走向了生态学。

经过充分暗适应后，所有电子门均处于开放态，打开测量光得到Fo，此时给出一个饱和脉冲，所有的电子门就都将该用于光合作用的能量转化为了荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为Fm。根据Fm和Fo可以计算出PS II的最大量子产量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潜在最大光合能力。

所谓饱和脉冲技术，就是打开一个持续时间很短（一般小于1 s）的强光关闭所有的电子门（光合作用被暂时抑制），从而使叶绿素荧光达到最大。饱和脉冲（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一个特例。光化光越强，PS II释放的电子越多，PQ处累积的电子越多，也就是说关闭态的电子门越多，F越高。当光化光达到使所有的电子门都关闭（不能进行光合作用）的强度时，就称之为饱和脉冲。

打开饱和脉冲时，本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热，F达到最大值。

在光照下光合作用进行时，只有部分电子门处于开放态。如果给出一个饱和脉冲，本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为Fm’。根据Fm’和F可以求出在当前的光照状态下PS II的实际量子产量Yield=ΦPSII=ΔF/Fm’=(Fm’-F)/Fm’，它反映了植物目前的实际光合效率。

光照状态下打开饱和脉冲时，电子门被完全关闭，光合作用被暂时抑制，也就是说光化学淬灭被全部抑制，但此时荧光值还是比Fm低，也就是说还存在荧光淬灭，这些剩余的荧光淬灭即为非光化学淬灭。淬灭系数的计算公式为：qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’)；qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo)；NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1。

在光照下光合作用进行时，只有部分电子门处于关闭态，实时荧光F比Fm要低，也就是说发生了荧光淬灭（quenching）。植物吸收的光能只有3条去路：光合作用、叶绿素荧光和热。根据能量守恒：1=光合作用+叶绿素荧光+热。可以得出：叶绿素荧光=1－光合作用－热。也就是说，叶绿素荧光产量的下降（淬灭）有可能是由光合作用的增加或热耗散的增加引起的。由光合作用的引起的荧光淬灭称之为光化学淬灭（photochemical quenching, qP）；由热耗散引起的荧光淬灭称之为非光化学淬灭（non-photochemical quenching, qN或NPQ）。光化学淬灭反映了植物光合活性的高低；非光化学淬灭反映了植物耗散过剩光能为热的能力，也就是光保护能力。

根据PS II的实际量子产量ΔF/Fm’和光合有效辐射（Photosynthetically Active Radiation, PAR）还可计算出光合电子传递的相对速率rETR=ΔF/Fm’·PAR·0.84·0.5。其中0.84是植物的经验性吸光系数，0.5是假设植物吸收的光能被两个光系统均分。

当F达到稳态后关闭光化光，同时打开远红光（Far-red Light, FL）（约持续3－5 s），促进PS I迅速吸收累积在电子门处的电子，使电子门在很短的时间内回到开放态，F回到最小荧光Fo附近，此时得到的荧光为Fo’。由于在野外测量Fo’不方便，因此野外版的调制荧光仪（除PAM-2100和WATER-PAM）外，多数不配置远红光。此时可以直接利用Fo代替Fo’来计算qP和qN，尽管得到的参数值有轻微差异，但qP和qN的变化趋势与利用Fo’计算时是一致的。由于NPQ的计算不需Fo’，近10几年来得到了越来越广泛的应用。

2常用型号

叶绿素 - 分类

叶绿素分为叶绿素a、叶绿素b、叶绿素c、叶绿素d、原叶绿素和细菌叶绿素等。

叶绿素名称存在场所最大吸收光带

叶绿素a所有绿色植物中红光和蓝紫光

叶绿素b高等植物、绿藻、眼虫藻、管藻红光和蓝紫光

叶绿素c硅藻、甲藻、褐藻红光和蓝紫光

叶绿素d红藻红光和蓝紫光

原叶绿素黄化植物（幼苗期）近于红光和蓝紫光

细菌叶绿素紫色细菌红光和蓝紫光

叶绿素 - 化学结构

叶绿素分子结构

19世纪初，俄国化学家、色层分析法创始人M.C.茨韦特用吸附色层分析法证明高等植物叶子中的叶绿素有两种成分。德国H.菲舍尔等经过多年的努力，弄清了叶绿素的复杂的化学结构。1960年美国R.B.伍德沃德领导的实验室合成了叶绿素a。至此,叶绿素的分子结构得到定论。

叶绿素分子是由两部分组成的：核心部分是一个卟啉环(porphyrin ring)，其功能是光吸收；另一部分是一个很长的脂肪烃侧链，称为叶绿醇(phytol)，叶绿素用这种侧链插入到类囊体膜。与含铁的血红素基团不同的是，叶绿素卟啉环中含有一个镁原子。叶绿素分子通过卟啉环中单键和双键的改变来吸收可见光。各种叶绿素之间的结构差别很小。如叶绿素a和b仅在吡咯环Ⅱ上的附加基团上有差异：前者是甲基，后者是甲醛基。细菌叶绿素和叶绿素a不同处也只在于卟啉环Ⅰ上的乙烯基换成酮基和环Ⅱ上的一对双键被氢化。

叶绿素 - 化学性质

高等植物叶绿体中的叶绿素主要有叶绿素a 和叶绿素b 两种。它们不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。叶绿素a分子式：C55H72O5N4Mg；叶绿素b分子式：C55H70O6N4Mg。在颜色上，叶绿素a 呈蓝绿色，而叶绿素b 呈黄绿色。按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇所酯化，另一个被叶醇所酯化。

叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾巴”。镁原子居于卟啉环的中央，偏向于带正电荷，与其相联的氮原子则偏向于带负电荷，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。叶绿素不参与氢的传递或氢的氧化还原，而仅以电子传递（即电子得失引起的氧化还原）及共轭传递（直接能量传递）的方式参与能量的传递。

卟啉环中的镁原子可被氢离子、铜离子、锌离子所置换。用酸处理叶片，氢离子易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色。去镁叶绿素易再与铜离子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定。人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿色植物标本。 叶绿醇是亲脂的脂肪族链，由于它的存在而决定了叶绿素分子的脂溶性，使之溶于丙酮、酒精、乙醚等有机溶剂中。由于在结构上的差别，叶绿素a呈蓝绿色，b呈黄绿色。在光下易被氧化而退色。叶绿素是双羧酸的酯，与碱发生皂化反应。

叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。酸性条件下，叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素。叶绿素溶液能进行部分类似光合作用的反应，在光下使某些化合物氧化或还原。人工制备的叶绿素膜在光下能产生光电位和光电流，也能催化某些氧化还原反应。

叶绿素 - 光和作用

光和作用

光合作用是指绿色植物通过叶绿体，利用光能，把二氧化碳和水转化成储存着能量的有机物，并且释放出氧的过程。光合作用的第一步是光能被叶绿素吸收并将叶绿素离子化。产生的化学能被暂时储存在三磷酸腺苷(ATP)中，并最终将二氧化碳和水转化为碳水化合物和氧气。

1864年，德国科学家萨克斯做了这样一个实验：把绿色叶片放在暗处几小时，目的是让叶片中的营养物质消耗掉。然后把这个叶片一半曝光，另一半遮光。过一段时间后，用碘蒸气处理叶片，发现遮光的那一半叶片没有发生颜色变化，曝光的那一半叶片则呈深蓝色。这一实验成功地证明了绿色叶片在光合作用中产生了淀粉。

1880年，德国科学家恩吉尔曼用水绵进行了光合作用的实验：把载有水绵和好氧细菌的临时装片放在没有空气并且是黑暗的环境里，然后用极细的光束照射水绵。通过显微镜观察发现，好氧细菌只集中在叶绿体被光束照射到的部位附近；如果上述临时装片完全暴露在光下，好氧细菌则集中在叶绿体所有受光部位的周围。恩吉尔曼的实验证明：氧是由叶绿体释放出来的，叶绿体是绿色植物进行光合作用的场所。　

将一片脱去淀粉的紫罗兰叶片放在阳光下数小时之后用碘试剂检测，可以发现只有叶片上绿色的区域变色而白色区域没有，也就是说只有绿色区域有淀粉存在。这显示了光合作用在缺乏叶绿素的情况下无法进行，叶绿素存在是光合作用的必要条件。

叶绿素 - 荧光现象和磷光现象

叶绿素荧光仪

叶绿素的可见光波段的吸收光谱，在蓝光和红光处各有一显著的吸收峰。吸收峰的位置和消光值的大小随叶绿素种类不同而有所不同。叶绿素a最大的吸收光的波长在420-663nm，叶绿素b 的最大吸收波长范围在460-645nm。当叶绿素分子位于叶绿体膜上时，由于叶绿素与膜蛋白的相互作用，会使光吸收的特性稍有改变。

叶绿素的酒精溶液在透射光下为翠绿色，而在反射光下为棕红色。这个红光就是叶绿素受光激发后发射的荧光。这个现象就是荧光现象。其主要原理是由于叶绿素有两个不同的吸收峰。叶绿素吸收光的能力极强，如果把叶绿素的丙酮提取液放在光源与分光镜之间，可以看到光谱中有些波长的光被吸收了。因此，在光谱上就出现了黑线或暗带，这种光谱叫吸收光谱。叶绿素吸收光谱的最强区域有两个：一个是在波长为640nm-660nm的红光部分，另一个在波长为430nm-450nm的蓝紫光部分。对其他光吸收较少，其中对绿光吸收最少，由于叶绿素吸收绿光最少，所以叶绿素的溶液呈绿色。叶绿素的丙酮提取液在透射光下是翠绿色的，而在反射光下是综红色的。 叶绿素溶液的荧光可达吸收光的10%左右。而鲜叶的荧光程度较低，指占其吸收光的0.1%-1%左右。

荧光效应在植物生理学中有广泛的应用。用这个效应可以研究植物的抗逆生理。因为在逆境下，植物的叶绿素会发生变换，研究其荧光，可以作为植物受逆境胁迫程度的指标。另外，还有一个磷光效应。就是当荧光出现后，立即中断光源，用灵敏的光学仪器还可在短时间内看到微弱红光，这就是磷光。

叶绿素 - 生物合成与代谢

叶绿素a的生物合成途径，是由琥珀酰辅酶A和甘氨酸缩合成δ-氨基乙酰丙酸，两个δ-氨基乙酰丙酸缩合成吡咯衍生物胆色素原，然后再由4个胆色素原聚合成一个卟啉环──原卟啉Ⅳ，原卟啉Ⅳ是形成叶绿素和亚铁血红素的共同前体，与亚铁结合就成亚铁血红素，与镁结合就成镁原卟啉。镁原卟啉再接受一个甲基，经环化后成为具有第Ⅴ环的原脱植醇基叶绿素，后者经光还原、酯化等步骤而形成叶绿素a。

落叶

叶绿素在活体内也和其他物质一样处于不断更新状态。它被叶绿素酶分解，或经光氧化而漂白。深秋时许多树种叶片呈美丽的红色，就是因为这时叶绿素降解速度大于合成速度，含量下降，原来被叶绿素所掩盖的类胡萝卜素、花色素的颜色显示出来的缘故。

在植物衰老和储藏过程中，酶能引起叶绿素的分解破坏。这种酶促变化可分为直接作用和间接作用两类。直接以叶绿素为底物的只有叶绿素酶，催化叶绿素中植醇酯键水解而产生脱植醇叶绿素。脱镁叶绿素也是它的底物，产物是水溶性的脱镁脱植叶绿素，它是橄榄绿色的。叶绿素酶的最适温度为60-82℃，100℃时完全失活。起间接作用的有蛋白酶、酯酶、脂氧合酶、过氧化物酶、果胶酯酶等。蛋白酶和酯酶通过分解叶绿素蛋白质复合体，使叶绿素失去保护而更易遭到破坏。脂氧合酶和过氧化物酶可催化相应的底物氧化，其间产生的物质会引起叶绿素的氧化分解。果胶酯酶的作用是将果胶水解为果胶酸，从而提高了质子浓度，使叶绿素脱镁而被破坏。

在活体绿色植物中，叶绿素既可发挥光合作用，又不会发生光分解。但在加工储藏过程中，叶绿素经常会受到光和氧气作用，被光解为一系列小分子物质而褪色。光解产物是乳酸、柠檬酸、琥珀酸、马来酸以及少量丙氨酸。因此，正确选择包装材料和方法以及适当使用抗氧化剂，以防止光氧化褪色。

叶绿素 - 提取

绿叶

叶绿素提取的准备工作是在一个半暗的房间里，室温保持在25℃。提取步骤如下：

(1) 取1000克新鲜的绿叶，在韦氏搅切器中粉碎。

(2)将粉碎的1000克绿叶放进加有少量的碳酸钙的丙酮中(温度20℃)进行萃取，直到过滤、清洗后的叶子碎片为无色。

(3)将过滤后的丙酮提取液放到盛有1升石油醚和100ml丙酮的漏斗中，然后轻轻地旋转，同时加放蒸馏水直到分层为止。水层的大部分丙酮和水溶杂质被丢弃，只剩石油醚溶液。

(4)将石油醚溶液用蒸馏水再次净化后，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上，最后得到黄绿色悬浮液。

(5)用无水硫酸钠对悬浮液进行干燥，并将其渗入到3cm厚的蔗糖粉末制成柱中，然后用石油醚清洗沉淀的色素去掉类胡萝卜素，使之只含有天然的叶绿素。

(6)含有天然叶绿素的蔗糖柱分两层，绿层有4-10mm的叶绿素b层，另一蓝层为2-6mm的叶绿素a层。

(7)将位于蓝层正中的部分(约占蓝层的一半) 放入醚中，对此悬浮液进行过滤、洗提，用蒸馏水清洗，用硫酸钠干燥，再用器皿进行过滤后，得到叶绿素a。

(8)将(6)中的绿层中间部分移出，迅速放入醚中过滤、洗提，制成叶绿素b醚溶液。

叶绿素 - 用途

叶绿素产品

造血功能

诺贝尔得奖人Dr.Richard Willstatter和Dr.Hans Fisher发现：叶绿素的分子与人体的红血球分子在结构上很是相似，唯一的分别就是各自的核心为镁原子与铁原子。因此，饮用叶绿素对产妇与因意外失血者会有很大的帮助。

帮助解除体内杀虫剂与药物残渣

营养学家Bernard Jensen博士指出，叶绿素能除去杀虫剂与药物残渣的毒素，并能与辐射性物质结合而将之排出体外。此外，他也发现一般上健康的人会比病患者拥有较高的血球计数，但通过吸收大量的叶绿素之后，病患者的血球计数就会增加，健康状况也会有所改善。

养颜美肤

新英国医药期刊曾经做过这样的报导：叶绿素有助于克制内部感染与皮肤问题。美国外科杂志报导：Temple大学在1200名病人身上，尝试以叶绿素医治各种病症，效果极佳。

叶绿素 - 新闻动态

澳研究人员偶然提取到新型叶绿素

澳大利亚悉尼大学生命科学学院研究人员宣布，他们发现了一种新叶绿素，它在生物能源领域可望拥有广阔的应用前景。